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眼见为实的电镜测序技术-【新闻】

发布时间:2021-05-28 16:59:32 阅读: 来源:织带机厂家

眼见为实的电镜测序技术

此前科学家们曾提出,基于电子显微镜的第三代DNA测序技术将能够得到超常的读长。今年有两项研究分别展示了这一理论的实用性,使电镜测序成为来年备受期待的新测序方法。

近年来,第二代测序技术得到了长足发展,而第三代测序技术也逐步商业化走入寻常百姓家,例如Pacific BioSciences和Helicos的单分子合成平台。不过,尽管这些技术都在测序通量和测序成本上实现了实质性突破,但对于高等真核生物(尤其是植物)DNA串联重复区域中的一些长重复序列而言,目前的测序读长还是不够,使人们难以对这些基因组区域进行可靠测序。

研究显示,以纳米孔为基础的第三代测序技术可以使测序读长达到megabases(Mb)级甚至更长,该技术被认为会在不久的将来进入市场。基于电子显微镜的第三代DNA测序方法也能够达到类似的读长,近期发表的两篇文章就展示了这一技术的巨大应用潜力,电镜测序绝对是2013年最值得关注的新测序技术之一。

利用电子显微镜EM直接读取DNA序列,这一概念并不新鲜但人们却一直没有实现这一技术。这是因为DNA四种碱基之间只有几个轻原子的差异,使人们很难通过电镜进行区分。用于增加透射电镜样本对比度的标准技术,被证明无法提供足够的对比度来区分DNA序列的差异。

用重原子对DNA 进行化学标记以提供区分碱基所需的对比度,这被认为是最值得一试的方法,不过人们此前的种种尝试都未能成功。Bell等人在研究中利用DNA聚合酶在DNA合成时编入了重金属标记的碱基(汞标记的dUTP)。在标记后,DNA被固定在一个薄薄的支持物上,通过DNA分子梳平行地获得分开且拉直了的单个DNA分子。随后研究人员使用环形暗场扫描透射电子显微镜对标记了的DNA进行成像,成功读取了3.2 kb DNA合成片段和7.2 kb病毒基因组中被标记的碱基,展现了电镜测序理论的实用性。研究者们正在进一步改进方法以识别更多的碱基类型,减少标记损失并读取更长的DNA片段。希望2013年这一新型测序技术,能够帮助人们大大超越现有测序读长。

在Bell的文章发表之后,Mankos及其同事也公布了自己的研究,他们通过另一种电镜进行测序,研究显示这一技术比Bell的方法更具优势。Mankos等人并未使用透射电镜TEM,而是采用了低能电子显微镜LEEM,这是一种高灵敏度的表面成像技术,能够得到单个原子层面的高对比度图像。理论上,使用改良版的LEEM可以直接在天然DNA中获得足够的对比度来区分不同碱基。这将是一大重要进步,因为人们将不再需要绞尽脑汁地对DNA样本进行标记,可以直接测序天然DNA。此外这一技术还有一个好处,与高分辨率TEM所需的高能电子相比,LEEM的低能电子不会对DNA样本产生可能引起错读的放射性损伤。

Mankos等研究人员提出的方法是,使DNA在分子梳上拉长,然后在对比度足以区分碱基的情况下进行LEEM成像。他们在初步实验中对大量DNA聚合物样本进行了研究,研究中的对比度足以区分DNA样本与背景,而且研究显示电子能量的微小变化会对DNA对比度产生重要影响。研究人员希望通过新设计的LEEM(单色、相差校正、双光束LEEM)来拓展他们的初步成果,获得能够区分DNA链中不同碱基的对比度。如果这一成果能够在2013年实现,将成为该领域中的重要里程碑。

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